丰富的种质资源是渔业生产的重要物质基础,保护和利用好海带种质资源将为提高海带品种水平、实现海带良种化生产提供重要保证,使我国这一具有传统优势的重要产业在新世纪仍然保持世界领先水平。低温生物学是探索低温条件下生命现象的特征和规律,以及保存生物体、细胞的一门科学。生物细胞、组织、器官、胚胎甚至个体在超低温(-196℃)状态下代谢完全停止,生命以静止的形式可以在这种状态下长期保存,解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性。将超低温保存技术成功应用于海带种质保存将有效解决藻类种质保存中污染、混杂、变异的问题,可望实现藻类种质的永久保存。 利用海带孢子与配子体为试验材料进行超低温冷冻保存技术研究,主要取得了以下研究成果： 在海带游(胚)孢子超低温保存技术方面,降温速率较快的两步法可以成功冻存孢子,DMSO是对孢子毒性最小且对冻存最有效的抗冻保护剂。采用5%DMSO平衡50 min以内,10%DMSO或甘油平衡15分钟以内,获得了70%以上的配子体发生率。液氮相中预冻后投液氮的简单方法获得了50%存活率。降温速率较快的方法适合孢子的冷冻保存,尤其是液面上方预冻后投液氮的方法可以获得更高的存活率。复苏后存活的孢子能萌发成配子体,配子体可无性繁殖,也可发育为孢子体,具有完全的再生能力。冻存孢子复苏后,存活孢子形成的雄配子体比例约60%,显著超过雌配子体40%的比例。超低温冷冻显著影响了复苏孢子发育为配子体的性别比例(one-wayANOVA,F=15.441,p0.001)。 在海带配子体超低温保存技术方面,降温速率较慢的两步法可成功冻存配子体克隆,获得了70%以上的存活率。降温速率、预冻温度及预冻时间对冻存复苏后配子体的存活率均有显著影响(p0.01),方差贡献率量级依次为预冻温度、预冻时间、降温速率、降温速率×预冻温度、预冻温度×预冻时间。在改善细胞抗冻性方面,预培养条件及性别的主效显著；雄系较雌系具有较强的抗冻性。经过冻存的海带无性繁殖系可以继续无性繁殖,也可发育为孢子体,具有完全的再生能力。 在海带配子体克隆的胶囊化脱水法保存技术方面,脱水率和脱水速率综合影响着冻存存活率,当含水量超过70%或低于20%,导致所有细胞的死亡。在胶球20%-70%含水量之间,三种脱水方法的配子体复苏存活率差异显著。其中采用低温冷藏柜阴干的干燥方法获得了较高的平均存活率。采用阴干法将胶球含水量降低到40%时获得了的存活率(one-way ANOVA,p0.01).在-40℃或-60℃下预冻30-60 min获得了较高的存活率(one-way ANOVA, p0.01)。其中,当胶球阴干脱水4 h,在-40℃或-60℃条件下预冻30 min效率。胶囊化脱水法与两步冻存法结合显示了对海带配子体的超低温保存较高的效率。胶囊化脱水法与两步冻存法结合使用为干燥敏感型种类提供了可行办法。不使用抗冻保护剂和昂贵的程序降温仪可获得43%的存活率。
